PCR, is é an imoibriú slabhra polaiméaráise, a thagraíonn do dNTP, Mg2+, fachtóirí fadaithe agus fachtóirí feabhsaithe aimplithe a chur leis an gcóras faoi chatalú DNA polymerase, ag baint úsáide as an tuismitheoir DNA mar theimpléad agus primers sonracha mar phointe tosaigh an síneadh , Trí na céimeanna dínádúraithe, annealaithe, sínte, etc., is féidir leis an bpróiseas chun DNA snáithe iníon a mhacasamhlú in vitro atá comhlántach leis an teimpléad snáithe tuismitheora DNA aon DNA sprice in vitro a mhéadú go tapa agus go sonrach.
1. PCR Tosaigh te
Ní hé an t-am tosaigh aimpliúcháin i PCR traidisiúnta ná an meaisín PCR a chur isteach sa mheaisín PCR, agus ansin tosaíonn an clár ag aimpliú.Nuair a bheidh cumraíocht an chórais críochnaithe, tosaíonn an t-aimpliú, rud a d'fhéadfadh aimpliú neamh-shonrach a chur faoi deara, agus is féidir le PCR te-tosaithe an fhadhb seo a réiteach.
Cad é PCR tosaithe te?Tar éis don chóras imoibrithe a bheith ullmhaithe, scaoiltear an modhnóir einsím ag teocht ard (de ghnáth níos airde ná 90 ° C) le linn chéim téimh tosaigh an imoibrithe nó le linn na céime "tús te", ionas go gcuirfear an DNA polymerase i ngníomh.Braitheann an t-am gníomhachtaithe cruinn agus an teocht ar nádúr an DNA polymerase agus an modhnóir te-tosaithe.Úsáideann an modh seo modhnóirí go príomha mar antasubstaintí, ligands cleamhnais, nó modhnóirí ceimiceacha chun bac a chur ar ghníomhaíocht DNA polymerase.Ós rud é go gcuirtear bac ar ghníomhaíocht DNA polymerase ag teocht an tseomra, soláthraíonn teicneolaíocht tús te áisiúlacht iontach chun córais imoibrithe PCR iolracha a ullmhú ag teocht an tseomra gan sainiúlacht imoibrithe PCR a íobairt.
2. RT-PCR
Teicníc thurgnamhach is ea RT-PCR (PCR trascríobh droim ar ais) chun tras-scríobh droim ar ais ó mRNA go cDNA agus a úsáid mar theimpléad le haghaidh aimplithe.Is é an nós imeachta turgnamhach RNA iomlán a bhaint as fíocháin nó cealla ar dtús, úsáid Oligo (dT) mar primer, bain úsáid as transcriptase droim ar ais chun cDNA a shintéisiú, agus ansin cDNA a úsáid mar theimpléad le haghaidh aimpliú PCR chun an spriocghéine a fháil nó léiriú géine a bhrath.
3. PCR cainníochtúil fluaraiseacha
PCR cainníochtúil fluaraiseacha (PCR Cainníochtúil Fíor-ama,RT-qPCR) tagraíonn sé don mhodh chun grúpaí fluaraiseacha a chur leis an gcóras imoibrithe PCR, ag baint úsáide as carnadh comharthaí fluaraiseacha chun monatóireacht a dhéanamh ar phróiseas iomlán PCR i bhfíor-am, agus ar deireadh úsáid a bhaint as an gcuar caighdeánach chun an teimpléad a anailísiú go cainníochtúil.I measc na modhanna qPCR a úsáidtear go coitianta tá SYBR Green I agus TaqMan.
4. PCR neadaithe
Tagraíonn PCR neadaithe le húsáid dhá shraith de primers PCR ar feadh dhá bhabhta de aimpliú PCR, agus is é an táirge aimplithe den dara babhta an blúire géine sprice.
Más rud é go n-aimseofar táirge neamhshonrach mar gheall ar mhí-mheaitseáil an chéad phéire primers (primers seachtracha), is beag an fhéidearthacht go n-aithneofar an réigiún neamhshonrach céanna ag an dara péire primers agus go leanfar ag amplify, mar sin is beag aimpliú ag an dara péire de primers , tá an sainiúlacht PCR feabhsaithe.Buntáiste amháin a bhaineann le dhá bhabhta PCR a dhéanamh ná go gcabhraíonn sé le táirge leordhóthanach a mhéadú ó DNA tosaigh teoranta.
5. Touchdown PCR
Is modh é Touchdown PCR chun sainiúlacht imoibrithe PCR a fheabhsú trí na paraiméadair timthriall PCR a choigeartú.
I touchdown PCR, socraítear an teocht annealing don chéad chúpla timthriall cúpla céim os cionn an uasteocht annealing (Tm) de na primers.Is féidir le teocht annealing níos airde aimpliú neamh-shonrach a laghdú go héifeachtach, ach ag an am céanna, cuirfidh teocht annealing níos airde le scaradh na primers agus na seichimh sprice, rud a fhágann go laghdófar táirgeacht PCR.Mar sin, sa chéad chúpla timthriall, is gnách go laghdóidh an teocht annealaithe 1 ° C in aghaidh an timthrialla chun ábhar na sprice géine sa chóras a mhéadú.Nuair a íslítear an teocht annealing go dtí an teocht is fearr, coinnítear an teocht annealing ar feadh na dtimthriallta atá fágtha.
6. PCR Díreach
Tagraíonn PCR díreach d'aimpliú DNA sprice díreach ón sampla gan aon ghá le leithlisiú agus íonú aigéad núicléasach.
Tá dhá chineál PCR díreach ann:
modh díreach: tóg méid beag sampla agus cuir go díreach é le PCR Master Mix le haghaidh aitheantais PCR;
modh scoilteadh: tar éis an sampla a shampláil, cuir leis an lysate é, lyse chun an genome a scaoileadh, tóg méid beag de shnáithín lysed agus cuir le PCR Master Mix é, sainaithint PCR a dhéanamh.Déanann an cur chuige seo an sreabhadh oibre turgnamhach a shimpliú, laghdaítear am láimhe, agus seachnaíonn sé caillteanas DNA le linn céimeanna íonúcháin.
7. SOE PCR
Splicing géine trí shíneadh forluí Úsáideann PCR (SOE PCR) primers le foircinn chomhlántacha chun táirgí PCR a dhéanamh mar slabhraí forluiteacha, ionas go mbeidh foinsí éagsúla de theicníc A ina ndéantar blúirí aimplithe san imoibriú aimpliúcháin ina dhiaidh sin, trí shlabhraí forluiteacha a shíneadh. agus spliced le chéile.Tá dhá phríomhthreo iarratais ag an teicneolaíocht seo faoi láthair: tógáil géinte comhleá;sóchán suíomh-dhírithe géine.
8. IPCR
Úsáideann Inbhéartach PCR (IPCR) primers comhlántacha droim ar ais chun blúirí DNA seachas an dá phriméir a aimpliú, agus a mhéadaíonn seichimh anaithnide ar an dá thaobh de bhlúire DNA aitheanta.
Dearadh IPCR ar dtús chun seicheamh na réigiún anaithnid in aice láimhe a chinneadh, agus úsáidtear é den chuid is mó chun staidéar a dhéanamh ar sheichimh tionscnóra géine;athshocruithe crómasómacha oncogenic, amhail comhleá géine, traslonnú agus trasuíomh;agus comhtháthú géine víreasach, a úsáidtear go coitianta anois freisin Chun mutagenesis suíomh-dírithe, a chóipeáil plasmid leis an sóchán atá ag teastáil.
9. dPCR
Teicníc é PCR digiteach (dPCR) chun móilíní aigéid núicléigh a chainníochtú absalóideach.
Faoi láthair tá trí mhodh ann chun móilíní aigéid núicléacha a chainníochtú.Tá fótaiméadracht bunaithe ar ionsú móilíní aigéid núicléigh;tá PCR cainníochtúil fluaraiseachta fíor-ama (Fíor-Ama PCR) bunaithe ar an luach Ct, agus tagraíonn an luach Ct don uimhir timthriall a fhreagraíonn don luach fluaraiseachta is féidir a bhrath;Is é PCR digiteach an teicneolaíocht chainníochtúil is déanaí atá bunaithe ar mhodh PCR aon-mhóilín chun cainníochtú aigéid núicléigh a chomhaireamh mar mhodh iomlán cainníochtúil.
Am postála: Meitheamh-13-2023